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顯微鏡基礎知識

日期:2022-05-26 01:46
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摘要:

 

**章: 顯微鏡簡史

隨著科學技術的進步,人們越來越需要觀察微觀世界,顯微鏡正是這樣的設備,它突破了人類的視覺極限,使之延伸到肉眼無法看清的細微結構。

顯微鏡是從十五世紀開始發展起來。從簡單的放大鏡的基礎上設計出來的單透鏡顯微鏡,到結構復雜的復式顯微鏡,以及相差,熒光,偏光,顯微觀察方式的出現,使之更廣范地應用于醫學,生物學,金屬材料,化工等領域。

 

**章 顯微鏡的基本光學原理

一. 折射和折射率

光線在均勻的各向同性介質中,兩點之間以直線傳播,當通過不同密度介質的透明物體時,則發生折射現象,這是由于光在不同介質的傳播速度不同造成的。當與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體(如玻璃)時,光線在其介面改變了方向,并和法線構成折射角。

二. 透鏡的性能

透鏡是組成顯微鏡光學系統的*基本的光學元件,物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個和多個透鏡組成。依其外形的不同,可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負透鏡)兩大類。

當一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點,這個點稱“焦點”,通過交點并垂直光軸的平面,稱“焦平面”。焦點有兩個,在物方空間的焦點,稱“物方焦點”,該處的焦平面,稱“物方焦平面”;反之,在象方空間的焦點,稱“象方焦點”,該處的焦平面,稱“象方焦平面”。

光線通過凹透鏡后,成正立虛像,而凸透鏡則成正立實像。實像可在屏幕上顯現出來,而虛像不能。

三. 影響成像的關鍵因素—相差

由于客觀條件,任何光學系統都不能生成理論上理想的象,各種象差的存在影響了成像質量。下面分別簡要介紹各種相差。

1. 色差(Chromatic aberration)

色差是透鏡成像的一個嚴重缺陷,發生在多色光為光源的情況下,單色光不產生色差。白光由紅橙 黃 綠 青 藍 紫 七種組成,各種光的波長不同 ,所以在通過透鏡時的折射率也不同,這樣物方一個點,在象方則可能形成一個色斑。

色差一般有位置色差,放大率色差。位置色差使像在任何位置觀察,都帶有色斑或暈環,使像模糊不清。而放大率色差使像帶有彩色邊緣

2. 球差(Spherical aberration)

球差是軸上點的單色相差,是由于透鏡的球形表面造成的。球差造成的結果是,一個點成像后,不在是個亮點,而是一個中間亮邊緣逐漸模糊的亮斑。從而影響成像質量。

球差的矯正常利用透鏡組合來消除,由于凸、凹透鏡的球差是相反的,可選配不同材料的凸凹透鏡膠合起來給予消除。舊型號顯微鏡,物鏡的球差沒有完全矯正,應與相應的補償目鏡配合,才能達到糾正效果。一般新型顯微鏡的球差完全由物鏡消除。

3. 慧差(Coma)

慧差屬軸外點的單色相差。軸外物點以大孔徑光束成象時,發出的光束通過透鏡后,不再相交一點,則一光點的象便會得到一逗點壯,型如慧星,故稱“慧差”。

4. 象散(Astigmatism)

象散也是影響清晰度的軸外點單色相差。當視場很大時,邊緣上的物點離光軸遠,光束傾斜大,經透鏡后則引起象散。象散使原來的物點在成象后變成兩個分離并且相互垂直的短線,在理想象平面上綜合后,形成一個橢圓形的斑點。象散是通過復雜的透鏡組合來消除。

5. 場曲(Curvature of field)

場曲又稱“象場彎曲”。當透鏡存在場曲時,整個光束的交點不與理想象點重合,雖然在每個特定點都能得到清晰的象點,但整個象平面則是一個曲面。這樣在鏡檢時不能同時看清整個相面,給觀察和照相造成困難。因此研究用顯微鏡的物鏡一般都是平場物鏡,這種物鏡已經矯正了場曲;。

6. 畸變(Distortion)

前面所說各種相差除場曲外,都影響象的清晰度?;兪橇硪环N性質的相差,光束的同心性不受到破壞。因此,不影響象的清晰度,但使象與原物體比,在形狀上造成失真。

四 顯微鏡的成象(幾何成象)原理

顯微鏡之所以能將被檢物體進行放大,是通過透鏡來實現的。單透鏡成象具有象差,嚴重影響成象質量。因此顯微鏡的主要光學部件都由透鏡組合而成。從透鏡的性能可知,只有凸透鏡才能起放大作用,而凹透鏡不行。顯微鏡的物鏡與目鏡雖都由透鏡組合而成,但相當于一個凸透鏡。為便于了解顯微鏡的放大原理,簡要說明一下凸透鏡的5種成象規律:

(1) 當物體位于透鏡物方二倍焦距以外時,則在象方二倍焦距以內、焦點以外形成縮小的倒立實象;

(2) 當物體位于透鏡物方二倍焦距上時,則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象;

(3) 當物體位于透鏡物方二倍焦距以內,焦點以外時,則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象;

(4) 當物體位于透鏡物方焦點上時,則象方不能成象;

(5) 當物體位于透鏡物方焦點以內時,則象方也無象的形成,而在透鏡物方的同側比物體遠的位置形成放大的直立虛象。

顯微鏡的成象原理就是利用上述(3)和(5)的規律把物體放大的。當物體處在物鏡前F-2F(F為物方焦距)之間,則在物鏡象方的二倍焦距以外形成放大的倒立實象。在顯微鏡的設計上,將此象落在目鏡的一倍焦距F1之內,使物鏡所放大的**次象(中間象),又被目鏡再一次放大,*終在目鏡的物方(中間象的同側)、人眼的明視距離(250mm)處形成放大的直立(相對中間象而言)虛象。因此,當我們在鏡檢時,通過目鏡(不另加轉換棱鏡)看到的象于原物體的象,方向相反。

五.顯微鏡光學系統簡介

顯微鏡光學系統的設計有二種光學系統。

1 長筒光學系統

2 萬能無限遠校正光學系統:是目前*先進的光路設計,它分體現了無限遠校正方式的優越性。光線通過物鏡后成為平行光束通過鏡筒,并在結象透鏡處折射或完成無相差的中間象。物鏡與觀察筒內結象透鏡之間可添加光學附件,而不影響總放大倍數。另外這種光學系統不需要安裝附加校正透鏡,都能得到*佳的顯微圖象。

 

第三章 顯微鏡的重要光學技術參數

在鏡檢時,人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象,這就需要顯微鏡的各項光學技術參數達到一定的標準,并且要求在使用時,必須根據鏡檢的目的和實際情況來協調各參數的關系。只有這樣,才能充分發揮顯微鏡應有的性能,得到滿意的鏡檢效果。

顯微鏡的光學技術參數包括:數值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數并不都是越高越好,它們之間是相互聯系又相互制約的,在使用時,應根據鏡檢的目的和實際情況來協調參數間的關系,但應以保證分辨率為準。

一. 數值孔徑

數值孔徑簡寫NA,數值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數,是判斷兩者(尤其對物鏡而言)性能高低的重要標志。其數值的大小,分別標科在物鏡和聚光鏡的外殼上。

數值孔徑(NA)是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率(h)和孔徑角(u)半數的正玄之乘積。用公式表示如下:

NA=hsinu/2

孔徑角又稱“鏡口角”,是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度??讖浇窃酱?,進入物鏡的光通亮就越大,它與物鏡的有效直徑成正比,與焦點的距離成反比。

顯微鏡觀察時,若想增大NA值,孔徑角是無法增大的,唯壹的辦法是增大介質的折射率h值?;谶@一原理,就產生了水浸系物鏡和油浸物鏡,因介質的折射率h值大于一,NA值就能大于一。

數值孔徑*大值為1.4,這個數值在理論上和技術上都達到了極限。目前,有用折射率高的溴萘作介質,溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。

這里必須指出,為了充分發揮物鏡數值孔徑的作用,在觀察時,聚光鏡的NA值應等于或略大于物鏡的NA值,

數值孔徑與其他技術參數有著密切的關系,它幾乎決定和影響著其他各項技術參數。它與分辨率成正比,與放大率成正比,與焦深成反比,NA值增大,視場寬度與工作距離都會相應地變小。

二. 分辨率

分辨率又稱“鑒別率”,“解像力”。是衡量顯微鏡性能的又一個重要技術參數。

顯微鏡的分辨率用公式表示為:d=l/NA

式中d為*小分辨距離;l為光線的波長;NA為物鏡的數值孔徑??梢娢镧R的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大,照明光線波長越短,則d值越小,分辨率就越高。

要提高分辨率,即減小d值,可采取以下措施

1. 降低波長l值,使用短波長光源。

2.曾大介質h值和提高NA值(NA=hsinu/2)。

3.增大孔徑角。

4.增加明暗反差。

三. 放大率

放大率就是放大倍數,是指被檢驗物體經物鏡放大再經目鏡放大后,人眼所看到的*終圖象的大小對原物體大小的比值,是物鏡和目鏡放大倍數的乘積。

放大率也是顯微鏡的重要參數,但也不能盲目相信放大率越高越好,在選擇時應首先考慮物鏡的數值孔徑。

四. 焦深

焦深為焦點深度的簡稱,即在使用顯微鏡時,當焦點對準某一物體時,不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚,而且在此平面的上下一定厚度內,也能看得清楚,這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層,而焦深小,則只能看到被檢物體的一薄層,焦深與其他技術參數有以下關系:

1.焦深與總放大倍數及物鏡的數值孔鏡成反比。

2.焦深大,分辨率降低。

由于低倍物鏡的景深較大,所以在低倍物鏡照相時造成困難。在顯微照相時將詳細介紹。

五. 視場直徑(Field of view)

觀察顯微鏡時,所看到的明亮的原形范圍叫視場,它的大小,是由目鏡里的視場光闌決定的。

視場直徑也稱視場寬度,是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大,愈便于觀察。

F=FN/Mob

F: 視場直徑,FN:視場數,Mob:物鏡放大率。

視場數(Field Number, 簡寫為FN),標刻在目鏡的鏡筒外側。

由公式可看出:

1. 視場直徑與視場數成正比。

2. 增大物鏡的倍數,則視場直徑減小。因此,若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌,而換成高倍物鏡,就只能看到被檢物體的很小一部份。

六. 覆蓋差

顯微鏡的光學系統也包括蓋玻片在內。由于蓋玻片的厚度不標準,光線從蓋玻片進入空氣產生折射后的光路發生了改變,從而產生了相差,這就是覆蓋差。覆蓋差的產生影響了顯微鏡的成響質量。

國際上規定,蓋玻片的標準厚度為0.17mm, 許可范圍在0.16—0.18mm.,在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內。物鏡外殼上標科的確0.17,即表明該物鏡要求蓋玻片的厚度。

七. 工作距離

工作距離也叫物距,即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時,被檢物體應處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此,它與焦距是兩個概念,平時習慣所說的調焦,實際上是調節工作距離。

在物鏡數值孔徑一定的情況下,工作距離短孔徑角則大。

數值孔徑大的高倍物鏡,其工作距離小。

 

第四章 顯微鏡的光學附件

顯微鏡得不償失光學部件包括物鏡,目鏡,聚光鏡及照明裝置幾個部分。各光學部件都直接決定和影響光學性能的優劣,現分述如下:

一.物鏡

物鏡是顯微鏡*重要的光學部件,利用光線使被檢物體**次成象,因而直接關系和影響成象的質量和各項光學技術參數,是衡量一臺顯微鏡質量的首要標準。

物鏡的結構復雜,制作精密,由于對象差的校正,金屬的物鏡筒內由相隔一定距離并被固定的透鏡組組合而成。物鏡有許多具體的要求,如合軸,齊焦。

齊焦既是在鏡檢時,當用某一倍率的物鏡觀察圖象清晰后,在轉換另一倍率的物鏡時,其成象亦應基本清晰,而且象的中心偏離也應該在一定的范圍內,也就是合軸程度。齊焦性能的優劣和合軸程度的高低是顯微鏡質量的一個重要標志,它是與物鏡的本身質量和物鏡轉換器的精度有關。

物鏡的種類很多,可從不同的角度分類,現分類介紹。

根據物鏡相差校正的程度進行分類,可分為:

1.消色差物鏡(Achromatic objective): 這是常見的物鏡,外殼上常有“Ach”字樣。這類物鏡僅能校正軸上點的位置色差(紅,藍二色)和球差(黃綠光)以及消除近軸點慧差。不能校正其它色光的色差和球差,且場曲很大。

2.復消色差物鏡(Apochromatic objective): 復消色差物鏡的結構復雜,透鏡采用了特種玻璃或螢石等材料制作而成,物鏡的外殼上標有“Apo” 字樣 ,這種物鏡不僅能校正紅綠藍三色光的色差,同時能校正紅,藍二色光的球差。由于對各種相差的校正極為完善,比響應倍率的消色差物鏡有更大的數值孔徑,這樣不僅分辨率高,象質量優而且也有更高的有效放大率。因此,復消色差物鏡的性能很高,適用于上等研究鏡檢和顯微照相.

3.半復消色差物鏡( Semi apochromatic objedtive): 半復消色差物鏡又稱氟石物鏡,物鏡,物鏡的外殼上標有“FL”字樣,在結構上透鏡的數目比消色差物鏡多,比負消色差物鏡少,成象質量上,遠較消色差物鏡為好,接近于復消色差物鏡。平場物鏡是在物鏡的透鏡系統中增加一快半月形的厚透鏡,以達到校正場曲的缺陷。平場物鏡的視場平坦,更適用于鏡檢和顯微照象。

4.特種物鏡:所謂“特種物鏡”是在上述物鏡的基礎上,專門為達到某些特定的觀察效果而設計制造的。主要有以下幾種:

(1) 帶校正環物鏡(Correction collar objective):

在物鏡的中部裝有環裝的調節環,當轉動調節環時,可調節物鏡內透鏡組之間的距離,從而校正由蓋玻片厚度不標準引起的覆蓋差。調節環上的刻度可從0 .11--.023,在物鏡的外殼上也標科有此數字,表明可校正蓋玻片從0.11—0.23mm厚度之間的誤差。

(2) 帶虹彩光闌的物鏡(Iris diaphragm objective ): 

在物鏡鏡筒內的上部裝有虹彩光闌,外方也可以旋轉的調節環,轉動時可調節光闌孔徑的大小,這種結構的物鏡是上等的油浸物鏡,它的作用是在暗視場鏡檢時,往往由于某些原因而使照明光線進入物鏡,使視場背景不夠黑暗,造成鏡檢質量的下降。這時調節光闌的大小,使背景變黑,使被檢物體更明亮,增強鏡檢效果。

(3)相襯物鏡(Phase contrast objective ):

這種物鏡是由于相襯鏡檢術的專用物鏡,其特點是在物鏡的后焦平面處裝有相板。

(4)無罩物鏡(No cover objective ): 有些被檢物體,如涂抹制片等,上面不能加用蓋玻片,這樣在鏡檢時應使用無罩物鏡,否則圖象質量將明顯下降,特別是在高倍鏡檢時更為明顯。這種物鏡的外殼上常標刻NC,同時在蓋玻片厚度的位置上沒有0.17的字樣,而標刻著“0”。

(5)長工作距離物鏡:這種物鏡是倒置顯微鏡的專用物鏡,它是為了滿足組織培養,懸浮液等材料的鏡檢而設計?!?/font>

二. 目鏡

目鏡的作用是把物鏡放大的實象(中間象)再放大一便,并把物象映入觀察者的眼中,實質上目鏡就是一個放大鏡。已知顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數值孔徑所決定的,而目鏡只是起放大作用。因此,對于物鏡不能分辨出的結構,目鏡放的再大,也仍然不能分辨出。

由于不同系列目鏡光學設計不同,所以不能混用。

三. 聚光鏡

聚光鏡又名聚光器,裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡,在使用數值孔徑0.40以上的物鏡時,則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光的性質,而且將光線聚焦于被檢物體上,以得到*好的照明效果。

聚光鏡的的結構有多種,同時根據物鏡數值孔徑的大小 ,相應地對聚光鏡的要求也不同 。

1. 阿貝聚光鏡(Abbe condenser)

這是由德國光學大學大師恩斯特。阿貝.(Ernst Abbe)設計。阿貝聚光鏡由兩片透鏡組成,有較好的聚光能力,但是在物鏡數值孔徑高于0.60時,則色差,球差就顯示出來。因此,多用于普通顯微鏡上。

2. 消色差聚光鏡(Achromatic aplanatic condenser )

這種聚光鏡又名“消色差消球差聚光鏡”和“齊明聚光鏡”它由一系列透鏡組成,它對色差球差的校正程度很高,能得到理想的圖象,是明場鏡檢中質量*高的一種聚光鏡,其NA值達1.4 。因此,在上等研究顯微鏡常配有此種聚光鏡。它不適用于4 X以下的低倍物鏡,否則照明光源不能充滿整個視場。

3. 搖出式聚光鏡( Swing out condenser)

在使用低倍物鏡時(如4X),由于視場大,光源所形成的光錐不能充滿真整個視場,造成視場邊緣部分黑暗,只中央部分被照亮。要使視場充滿照明,就需將聚光鏡的上透鏡從光路中搖出。

4. 其它聚光鏡:

聚光鏡除上述明場使用的類型外,還有作特殊用途的聚光鏡。如暗視野聚光鏡,相襯聚光鏡,偏光聚光鏡,微分干涉聚光鏡等,以上聚光鏡分別適用于相應的觀察方式。

四.顯微鏡的照明裝置

顯微鏡的照明方法按其照明光束的形成,可分為“透射式照明”,和“落射式照明”兩大類。前者適用于透明或半透明的被檢物體,絕大數生物顯微鏡屬于此類照明法;后者則適用于非透明的被檢物體,光源來自上方,又稱“反射式或落射式照明”。主要應用與金相顯微鏡或熒光鏡檢法。

1. 透射式照明

透射式照明法分中心照明和斜射照明兩種形式:

(1) 中心照明:這是*常用的透射式照明法,其特點是照明光束的中軸與顯微鏡的光軸同在一條直線上。它又分為“臨界照明”和“柯勒照明”兩種。

A. 臨界照明(Critical illumination):這是普通的照明法。這種照明的特點是光源經聚光鏡后成象在被檢物體上,光束狹而強,這是它的優點。但是光源的燈絲象與被檢物體的平面重合,這樣就造成被檢物體的照明呈現出不均勻性,在有燈絲的部分則明亮;無燈絲的部分則暗淡,不僅影響成象的質量,更不適合顯微照相,這是臨界照明的主要缺陷。其補救的方法是在光源的前方放置乳白和吸熱濾色片,使照明變得較為均勻和避免光源的長時間的照射而損傷被檢物體。

B. 柯勒照明:柯勒照明克服了臨界照明的缺點,是研究用顯微鏡中的理想照明法。這中照明法不僅觀察效果佳,而且是成功地進行顯微照相所必須的一種照明法。光源的燈絲經聚光鏡及可變視場光闌后,燈絲象**次落在聚光鏡孔徑的平面處,聚光鏡又將該處的后焦點平面處形成**次的燈絲象。這樣在被檢物體的平面處沒有燈絲象的形成,不影響觀察。此外照明變得均勻。

觀察時,可改變聚光鏡孔徑光闌的大小,使光源充滿不同物鏡的入射光瞳,而使聚光鏡的數值孔徑與物鏡的數值孔徑匹配。同時聚光鏡又將視場光闌成象在被檢物體的平面處,改變視場光闌的大小可控制照明范圍。此外,這種照明的熱焦點不在被檢物體的平面處,即使長時間的照明,也不致損傷被檢物體。

(2) 斜射照明:這種照明光束的中軸與顯微鏡的光軸不在一直線上,而是與光軸形成一定的角度斜照在物體上,因此成斜射照明。相襯顯微術和暗視野顯微術就是斜射照明。

2. 落射式照明

這種照明的光束來自物體的上方通過物鏡后射到被檢物體上,這樣物鏡又起著聚光鏡的作用。這種照明法是適用于非透明物體,如金屬,礦物等。

四. 顯微鏡的光軸調節

在顯微鏡的光學系統中,光源、聚光鏡、物鏡和目鏡的光軸以及光闌的中心必須與顯微鏡的光軸同在一直線上,所以在鏡檢前必須進行顯微鏡光軸的調節,否則不能達到*佳觀察效果。

1. 光源燈絲調節:舊式顯微鏡需要調節燈泡的位置。目前的新型顯微鏡的光源已經進行了予定心設置,所以不需要調整。

2. 聚光鏡的中心調整:實際上顯微鏡光軸的調整的重點即是聚光鏡的位置調整。

首先將視場光闌縮小,用10X物鏡觀察,在視場內可見到視場光闌的輪廓,如果不在中央,則利用聚光鏡外側的兩個調整螺釘將其調至中央部分,當緩慢地增大視場光闌時,能看到光束向視場周緣均勻展開直至視場光闌的輪廓象完全與視場邊緣內接,說明已經和軸。和軸后再略為增大視場光闌,使輪廓象剛好處于視場外切或略大。

3. 孔徑光闌的調節:孔徑光闌安裝在聚光鏡內,研究用顯微鏡的聚光鏡的外側邊緣上都有科數及定位記號,這樣便于調節聚光鏡與物鏡的數值孔徑相匹配,原則上說更換物鏡時需調整聚光鏡的數值孔徑,一般物鏡的數值孔徑乘0.6或0.8就是聚光鏡的數值孔徑。

 

第五章 各種顯微鏡檢術介紹

前面講述了顯微鏡的光學原理以及附件,下面將分類介紹一下各類研究用鏡檢術。在生物研究領域,透射式明場顯微鏡得到廣泛應用,在此基礎上各種特殊的鏡檢方法也得到應用,如相襯,熒光,干涉,暗場,這些鏡檢方法在上等顯微鏡上均能同時實現。

**節 正立式顯微鏡

一. 明視野觀察(Bright field)

明視野鏡檢是大家比較熟悉的一種鏡檢方式,廣泛應用于病理、檢驗,用于觀察被染色的切片,所有顯微鏡均能完成此功能。在此不再贅述。

二. 暗視野觀察(Dark field)

暗視野實際是暗場照明發。它的特點和明視野不同,不直接觀察到照明的光線,而觀察到的是被檢物體反射或衍射的光線。因此,視場成為黑暗的背景,而被檢物體則呈現明亮的象。

暗視野的原理是根據光學上的丁道爾現象,微塵在強光直射通過的情況下,人眼不能觀察,這是因為強光繞射造成的。若把光線斜射它,由于光的反射,微粒似乎增大了體積,為人眼可見。

暗視野觀察所需要的特殊附件是暗視野聚光鏡。它的特點是不讓光束由下至上的通過被檢物體,而是將光線改變途徑,使其斜射向被檢物體,使照明光線不直接進入物鏡,利用被檢物體表面反射或衍射光形成的明亮圖象。

暗視野觀察的分辨率遠高于明視野觀察,*高達0.02—0.004mm..

三.相襯鏡檢法(Phase contrast)

在光學顯微鏡的發展過程中,相襯鏡檢術的發明成功,是近代顯微鏡技術中的重要成就。我們知道,人眼只能區分光波的波長(顏色)和振幅(亮度),對于無色通明的生物標本,當光線通過時,波長和振幅變化不大,在明場觀察時很難觀察到標本.

相襯顯微鏡利用被檢物體的光程之差進行鏡檢,也就是有效地利用光的干涉現象,將人眼不可分辨的相位差變為可分辨的振幅差,即使是無色透明的物質也可成為清晰可見。這大大便利了活體細胞的觀察,因此相襯鏡檢法廣泛應用于倒置顯微鏡。

相襯鏡檢法在裝置上與明場不同,有一些特殊要求:

1. 環狀光闌(Ring slit): 裝在聚光鏡的下方,而與聚光鏡組合為一體---相襯聚光鏡。它是由大小不同的環形光闌裝在一圓盤內,外面標有10X、20X、40X、100X等字樣,與相對應倍數的物鏡配合使用。

2. 相板(Phase plate): 裝在物鏡的后焦平面處,它分為兩部分,一是通過直射光的部分,為半透明的環狀,叫共軛面;另一是通過衍射光的部分,叫“補償面”。有相板的物鏡稱“相襯物鏡”,外殼上常有“Ph”字樣。

相襯鏡檢法是一種比較復雜的鏡檢方法,想要得到好的觀察效果,顯微鏡的調試非常重要。除此之外還應注意以下幾個方面。

1. 光源要強,全部開啟孔徑光闌;

2. 使用濾色片,使光波近于單色;

四.微分干涉稱鏡檢術(Differential interference contrast DIC)

微分干涉鏡檢術出現于60年代,它不僅能觀察無色透明的物體,而且圖象呈現出浮雕壯的立體感,并具有相襯鏡檢術所不能達到的某些優點,觀察效果更為逼真。

1. 原理

微分干涉稱鏡檢術是利用特制的渥拉斯頓棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動方向相互垂直且強度相等,光束分別在距離很近的兩點上通過被檢物體,在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小,而不出現重影現象,使圖象呈現出立體的三維感覺。

2. 微分干涉稱鏡檢術所需的特殊部件:

(1) 起偏鏡

(2) 檢偏鏡

(3) 渥拉斯頓棱鏡2 塊

3. 微分干涉稱鏡檢時的注意事項

(1)因微分干涉襯靈敏度高,制片表面不能有污物和灰塵。

(2)具有雙折射性的物質,不能達到微分干涉襯鏡檢鏡檢的效果。

(3)倒置顯微鏡應用微分干涉襯時,不能用塑料培養皿。

五 熒光鏡檢術

熒光鏡檢術是用短波長的光線照射用熒光素染色過的被檢物體,使之受激發后而產生長波長的熒光,然后觀察。熒光鏡檢術廣泛應用于生物,醫學等領域。

1.熒光鏡檢術一般分為透射和落射式兩種類型。

(1)透射式:激發光來自被檢物體的下方,聚光鏡為暗視野聚光鏡,使激發光不進入物鏡,而使熒光進入物鏡。它在低倍情況下明亮,而高倍則暗,在油浸和調中時,較難操作,尤以低倍的照明范圍難于確定,但能得到很暗的視野背景。透射式不使用于非透明的被檢物體。

(2)落射式:透射式目前幾乎被淘汰,新型的熒光顯微鏡多為落射式,光源來自被檢物體的上方,在光路中具有分光鏡,所以對透明和不透明的被檢物體都適用。由于物鏡起了聚光鏡的作用,不僅便于操作,而且從低倍到高倍,可以實現整個視場的均勻照明。

2.熒光鏡檢術的注意事項

(1) 激發光長時間的照射,會發生熒光的衰減和淬滅現象,因此盡可能縮短觀察時間,暫時不觀察時,應用擋板遮蓋激發光。

(2)作油鏡觀察時,應用“無熒光油”。

(3)熒光幾乎都較弱,應在較暗的室內進行。

(4)電源*好裝穩壓器,否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命,也會影響鏡檢的效果。

目前許多新興生物研究領域應用到熒光顯微鏡,如基因原位雜交(FISH)等等。

**節 偏光顯微鏡(Polarizing microscope )

一.偏光顯微鏡的特點

偏光顯微鏡是鑒定物質細微結構光學性質的一種顯微鏡。凡具有雙折射的物質,在偏光顯微鏡下就能分辨的清楚,當然這些物質也可用染色發來進行觀察,但有些則不可能,而必須利用偏光顯微鏡。

偏光顯微鏡的特點,就是將普通改變為偏光進行鏡檢的方法,以鑒別某一物質是單折射(各向同行)或雙折射性(各向異性)。

雙折射性是晶體的基本特性。因此,偏光顯微鏡被廣泛地應用在礦物,化學等領域。在生物學和植物學也有應用。

二.偏光顯微鏡的基本原理

偏光顯微鏡的原理比較復雜,在此不作過多介紹,偏光顯微鏡必須具備以下附件(a)起偏鏡 (b)檢偏鏡 (c)專用無應力物鏡(d)旋轉載物臺。

三. 偏光鏡檢術的方式

(一) 正相鏡檢(Orthscope):又稱無畸變鏡檢,其特點是使用低倍物鏡,不用伯特蘭透鏡(Bertrand Lens),同時為使照明孔徑變小,推開聚光鏡的上透鏡。

正相鏡檢用于檢查物體的雙折射性。

(二) 錐光鏡檢(Conoscope):又稱干涉鏡檢,這種方法用于觀察物體的單軸或雙軸性。

三. 偏光顯微鏡在裝置上的要求

(一) 光源:*好采用單色光,因為光的速度,折射率,和干涉現象由于波長的不同而有差異。一般鏡檢可使用普通光。

(二) 目鏡:要帶有十字線的目鏡。

(三) 聚光鏡:為了取得平行偏光,應使用能推出上透鏡的搖出式聚光鏡。

(四) 伯特蘭透鏡:這是把物體所有造成的初級相放大為次級相的輔助透鏡。

四. 偏光鏡檢術的要求

(一) 載物臺的中心與光軸同軸。

(二) 起偏鏡和檢偏鏡應處于正交位置。

(三) 制片不宜過薄。

第三節 倒置顯微鏡(Inverted microscope)

前面講的是正立式顯微鏡的鏡檢方式,主要用于切片的觀察。而倒置顯微鏡是為了適應生物學、醫學等領域中的組織培養、細胞離體培養、浮游生物、環境保護、食品檢驗等顯微觀察。

由于上述樣品特點的限制,被檢物體均放置在培養皿(或培養瓶)中,這樣就要求倒置顯微鏡的物鏡和聚光鏡的工作距離很長,能直接對培養皿中的被檢物體進行顯微觀察和研究。因此,物鏡、聚光鏡和光源的位置都顛倒過來,故稱為“倒置顯微鏡”。

由于工作距離的限制,倒置顯微鏡物鏡的*大放大率為60X。一般研究用倒置顯微鏡都配置有4X、10X、20X、及40X 相差物鏡,因為倒置顯微鏡多用于無色透明的活體觀察。如果用戶有特殊需要,也可以選配其它附件,用來完成微分干涉、熒光及簡易偏光等觀察。

目前倒置顯微鏡廣泛應用于patch-clamp ,transgene ICSI 等領域。

第四節 體視顯微鏡(Stereo microscope)

體視顯微鏡又稱“實體顯微鏡”或“解剖鏡”,是一種具有正象立體感地目視儀器,被廣泛地應用于生物學、醫學、農林、工業及海洋生物各部門。它具有如下地特點:

1. 雙目鏡筒中的左右兩光束不是平行,而是具有一定的夾角---體視角(一般為12度---15度),因此成象具有三維立體感;

2. 象是直立的,便于操作和解剖,這是由于在目鏡下方的棱鏡把象倒轉過來的緣故;

3. 雖然放大率不如常規顯微鏡,但其工作距離很長

4. 焦深大,便于觀察被檢物體的全層。

5. 視場直徑大。

目前體視鏡的光學結構是:由一個共用的初級物鏡,對物體成象后的兩光束被兩組中間物鏡----變焦鏡分開,并成一體視角再經各自的目鏡成象,它的倍率變化是由改變中間鏡組之間的距離而獲得的,因此又稱為“連續變倍體視顯微鏡”(Zoom—stereo microscope)。

隨著應用的要求,目前體視鏡可選配豐富的選購附件,如熒光,照相,攝象,冷光源等等。

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